খবর

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) হল β-galactosidase সাবস্ট্রেটের একটি অ্যানালগ, যা অত্যন্ত প্ররোচিত।আইপিটিজির আবেশের অধীনে, প্রবর্তক দমনকারী প্রোটিনের সাথে একটি জটিল গঠন করতে পারে, যাতে দমনকারী প্রোটিনের রূপান্তর পরিবর্তিত হয়, যাতে এটি লক্ষ্য জিনের সাথে মিলিত হতে না পারে এবং লক্ষ্য জিনটি দক্ষতার সাথে প্রকাশ করা হয়।তাহলে কিভাবে পরীক্ষার সময় IPTG এর ঘনত্ব নির্ধারণ করা উচিত?বড় হয় ভাল?
প্রথমে, আসুন IPTG আনয়নের নীতিটি বুঝতে পারি: E. coli-এর ল্যাকটোজ অপারন (উপাদান) তিনটি স্ট্রাকচারাল জিন রয়েছে, Z,Y, এবং A, যা যথাক্রমে β-galactosidase, permease এবং acetyltransferase এনকোড করে।ল্যাকজেড ল্যাকটোজকে গ্লুকোজ এবং গ্যালাকটোজ বা অ্যালো-ল্যাকটোজে পরিণত করে;lacY পরিবেশে ল্যাকটোজকে কোষের ঝিল্লির মধ্য দিয়ে যেতে দেয় এবং কোষে প্রবেশ করে;lacA অ্যাসিটাইল গ্রুপকে এসিটাইল-কোএ থেকে β-গ্যালাকটোসাইডে স্থানান্তর করে, যার মধ্যে বিষাক্ত প্রভাব অপসারণ জড়িত।এছাড়াও, একটি অপারেটিং সিকোয়েন্স O, একটি প্রারম্ভিক ক্রম P এবং একটি নিয়ন্ত্রক জিন I রয়েছে। I জিন কোড হল একটি রিপ্রেসার প্রোটিন যা অপারেটর সিকোয়েন্সের O অবস্থানের সাথে আবদ্ধ হতে পারে, যাতে অপারন (মেটা) দমন করা হয় এবং বন্ধ করা.ক্যাটাবলিক জিন অ্যাক্টিভেটর প্রোটিন-সিএপি বাইন্ডিং সাইটের জন্য একটি বাইন্ডিং সাইটও রয়েছে ইনিশিয়েটিং সিকোয়েন্স পি-এর আপস্ট্রিমে। পি সিকোয়েন্স, ও সিকোয়েন্স এবং সিএপি বাইন্ডিং সাইট একসাথে ল্যাক অপেরনের নিয়ন্ত্রক অঞ্চল গঠন করে।জিন পণ্যগুলির সমন্বিত অভিব্যক্তি অর্জনের জন্য তিনটি এনজাইমের কোডিং জিনগুলি একই নিয়ন্ত্রক অঞ্চল দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়।

ল্যাকটোজ অনুপস্থিতিতে, ল্যাক অপেরন (মেটা) অবদমনের অবস্থায় রয়েছে।এই সময়ে, PI প্রমোটার সিকোয়েন্সের নিয়ন্ত্রণে I সিকোয়েন্স দ্বারা প্রকাশ করা ল্যাক রিপ্রেসারটি O সিকোয়েন্সের সাথে আবদ্ধ হয়, যা RNA পলিমারেজকে P সিকোয়েন্সের সাথে আবদ্ধ হতে বাধা দেয় এবং ট্রান্সক্রিপশন সূচনাকে বাধা দেয়;যখন ল্যাকটোজ উপস্থিত থাকে, তখন ল্যাক অপেরন (মেটা) প্ররোচিত হতে পারে এই অপেরন (মেটা) সিস্টেমে, প্রকৃত প্রবর্তক নিজেই ল্যাকটোজ নয়।ল্যাকটোজ কোষে প্রবেশ করে এবং β-galactosidase দ্বারা অনুঘটক হয়ে অ্যালোলাকটোজে রূপান্তরিত হয়।পরেরটি, একটি প্রবর্তক অণু হিসাবে, দমনকারী প্রোটিনের সাথে আবদ্ধ হয় এবং প্রোটিনের গঠন পরিবর্তন করে, যা O ক্রম এবং প্রতিলিপি থেকে দমনকারী প্রোটিনের বিচ্ছিন্নতার দিকে পরিচালিত করে।আইসোপ্রোপাইলথিওগাল্যাক্টোসাইড (আইপিটিজি) অ্যালোলাকটোজের মতো একই প্রভাব ফেলে।এটি একটি খুব শক্তিশালী প্রবর্তক, যা ব্যাকটেরিয়া দ্বারা বিপাক হয় না এবং খুব স্থিতিশীল, তাই এটি পরীক্ষাগারে ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়।

কিভাবে IPTG এর সর্বোত্তম ঘনত্ব নির্ধারণ করবেন?উদাহরণ হিসেবে E. coli নিন।
পজিটিভ রিকম্বিন্যান্ট pGEX (CGRP/msCT) সমন্বিত ই. কোলাই BL21 জেনেটিক্যালি ইঞ্জিনিয়ারড স্ট্রেনকে 50μg·mL-1 Amp সমন্বিত LB লিকুইড মিডিয়ামে টিকা দেওয়া হয়েছিল এবং 37°C তাপমাত্রায় রাতারাতি কালচার করা হয়েছিল।সম্প্রসারণ সংস্কৃতির জন্য 1:100 অনুপাতে 50μg·mL-1 Amp সমন্বিত 50mL তাজা LB তরল মাঝারিটির 10 বোতলের মধ্যে উপরের সংস্কৃতিটিকে টিকা দেওয়া হয়েছিল, এবং যখন OD600 মান 0.6~0.8 ছিল, IPTG চূড়ান্ত ঘনত্বে যোগ করা হয়েছিল।এটি 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1।একই তাপমাত্রায় এবং একই সময়ে আনয়নের পরে, এটি থেকে 1 মিলি ব্যাকটেরিয়াল দ্রবণ নেওয়া হয়েছিল, এবং ব্যাকটেরিয়া কোষগুলিকে সেন্ট্রিফিউগেশনের মাধ্যমে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং প্রোটিনের অভিব্যক্তিতে বিভিন্ন IPTG ঘনত্বের প্রভাব বিশ্লেষণ করার জন্য SDS-PAGE-এর অধীন করা হয়েছিল, এবং তারপর বৃহত্তম প্রোটিন অভিব্যক্তি সহ IPTG ঘনত্ব নির্বাচন করুন।
পরীক্ষা-নিরীক্ষার পর দেখা যাবে যে IPTG-এর ঘনত্ব যতটা সম্ভব ততটা বড় নয়।এর কারণ হল IPTG ব্যাকটেরিয়ার একটি নির্দিষ্ট বিষাক্ততা আছে।ঘনত্ব অতিক্রম করা কোষকেও মেরে ফেলবে;এবং সাধারণভাবে বলতে গেলে, আমরা আশা করি যে কোষে যত বেশি দ্রবণীয় প্রোটিন প্রকাশ করা হবে, তত ভাল, তবে অনেক ক্ষেত্রে যখন IPTG-এর ঘনত্ব খুব বেশি হয়, প্রচুর পরিমাণে অন্তর্ভুক্তি তৈরি হবে।শরীরে কিন্তু দ্রবণীয় প্রোটিনের পরিমাণ কমে গেছে।অতএব, সবচেয়ে উপযুক্ত আইপিটিজি ঘনত্ব প্রায়শই বড় হয় না তত ভাল, তবে ঘনত্ব কম।
জেনেটিক্যালি ইঞ্জিনিয়ারড স্ট্রেনের আনয়ন এবং চাষের উদ্দেশ্য হল লক্ষ্য প্রোটিনের ফলন বাড়ানো এবং খরচ কমানো।টার্গেট জিনের অভিব্যক্তি শুধুমাত্র স্ট্রেনের নিজস্ব কারণ এবং এক্সপ্রেশন প্লাজমিড দ্বারা প্রভাবিত হয় না, বরং অন্যান্য বাহ্যিক অবস্থার দ্বারাও প্রভাবিত হয়, যেমন প্রবর্তকের ঘনত্ব, আনয়ন তাপমাত্রা এবং আনয়ন সময়।অতএব, সাধারণভাবে, একটি অজানা প্রোটিন প্রকাশ এবং শুদ্ধ করার আগে, উপযুক্ত শর্ত নির্বাচন করতে এবং সর্বোত্তম পরীক্ষামূলক ফলাফল পেতে আনয়ন সময়, তাপমাত্রা এবং IPTG ঘনত্ব অধ্যয়ন করা ভাল।